독성시험에관한 용어 정의

단회투여독성시험 (Single Dose Toxicity study)

회투여독성시험은 시험물질을 실험동물에 단회투여(24시간 이내의 분할 투여하는 경우도 포함)하였을 때 단기간 내에 나타나는 독성을 질적·양적으로 검사하는 시험을 말한다. 설치류에 있어서 기존에 요구되어 왔던 반수치사용량(이하 LD50)은 고정된 것이 아니며 시험조건의 차이에 의해 수치의 변동이 큰 생물학적 지표이다. 더욱이 동물복지의 관점에서 다수의 동물을 희생함으로써 LD50을 구하는 것이 문제가 되었다. 따라서 LD50을 구하기보다는 오히려 시험물질을 투여한 후에 일어나는 모든 변화(독성변화)와 용량과의 관계를 파악하는 것에 초점을 둔 시험이 바람직하다고 판단된다.

 

단회투여독성시험의 경우「의약품등의 독성시험기준」과 OECD 독성시험 가이드라인(Test Guideline)이 서로 일치하지 않는 부분이 있다(예: OECD TG420, TG423, TG425). 따라서 OECD 독성시험 가이드라인을 준용하는 시험의 경우 별도로 발간된 안내서(「식품 등의 독성시험법 가이드라인-단회투여독성」)를 참고하는 것이 바람직하다.

 

반복투여독성시험 (Repeated Dose Toxicity study)

반복투여독성시험은 시험물질을 실험동물에 반복투여하여 중·장기간 내에 나타나는 독성을 질적, 양적으로 검사하는 시험을 말한다. 용량단계는 적어도 3단계 시험물질 투여군으로 하고, 최대내성용량 및 최대무작용량 등을 포함하여 용량반응관계가 나타날 수 있도록 설정한다. 독성변화의 가역성과 지연성 독성을 검토하기 위해 회복군을 두어 시험하는 것이 바람직하다.

 

반복투여독성시험의 경우「의약품등의 독성시험기준」과 OECD 독성시험 가이드라인(Test Guideline)이 서로 일치하지 않는 부분이 있다(예: OECD TG408, TG407). 따라서 OECD 독성시험 가이드라인을 준용하는 시험의 경우 별도로 발간된 안내서(「식품 등의 독성시험법 가이드라인-반복투여독성」)를 참고하는 것이 바람직하다.

 

생식·발생독성시험 (Reproductive and Developmental Toxicity study)

생식·발생독성시험이란 시험물질이 포유류의 생식·발생에 미치는 영향을 규명하는 시험을 말한다. 시험결과는 생식·발생에 대한 의약품 등의 안전성 평가에 이용된다. 생식·발생에 미치는 영향으로는 생식세포의 형성 장애, 수태저해, 임신유지, 분만, 포육 등에 대한 영향, 차세대의 발육 지연 및 기형 발생 등에 대한 영향, 출생 후 성장과 발달, 생식능에 대한 영향 등이 있다. 「의약품등의 독성시험기준」(식품의약품안전처 고시)의 생식·발생독성시험에서는 포유동물을 이용하여 의약품 등의 생식·발생에 대한 영향을 일차적으로 검색하는 시험법(기본시험)을 제시하고 있다. 따라서 어떠한 영향이 인정되는 경우 그 영향의 본질 및 발생기전의 규명 등 사람에게 적용하기 위해 필요한 추가 시험을 계획하는 것이 중요하다.

 

「의약품등의 독성시험기준」(식품의약품안전처 고시)의 생식·발생독성시험에서는 표준시험법, 단일시험법 그리고 조합시험법을 제시하고 있다. 각 시험법의 주요 내용은 다음과 같다.

 

① 표준시험법 : 생식·발생독성시험의 기본이 되는 시험법으로서 “수태능 및 초기배 발생시험(SegmentⅠ)”, “배·태자 발생시험(SegmentⅡ)”, “출생 전·후 발생 및 모체기능시험(SegmentⅢ)” 으로 세분화 한다.

② 단일시험법 : 표준시험법 중 “수태능 및 초기배 발생시험법”과 “출생 전·후 발생 및 모체기능시험”의 투여기간을 하나로 통합하는 시험법이다.

③ 조합시험법 : 두 가지 종류로 구분할 수 있는데 첫 번째는 “수태능 및 초기배 발생시험”과 “배·태자 발생시험”을 포함한 “출생 전·후 발생 및 모체기능시험”으로 조합하는 시험법이다. 두 번째는 “수태능 및 초기배 발생시험”의 투여를 경구개 폐쇄까지 계속하여 “배·태자 발생시험”을 포함하고 별도의 “출생 전·후 발생 및 모체기능시험”을 조합하는 시험법이다.

 

유전독성시험 (Genetic Toxicity study)

유전독성이란 기존에는 세포 또는 개체 수준에서 돌연변이(mutation)를 유발하는 성질을 의미하였으나 현재는 유전물질(DNA)에 상해성을 나타내는 성질(genetic toxicity)을 포함하는 광범위한 의미로 이용되고 있다. 유전독성시험은 시험계와 평가항목에 따라 여러 방법이 있으나 「의약품등의 독성시험기준」(식품의약품안전처 고시)에 설명된 시험법들이 현재 우리나라 의약품 등의 유전독성 평가에 적용되는 대표적인 시험법이다. 이들 시험법은 평가항목의 차이에 따라 다음과 같이 크게 4개의 군으로 나눌 수 있다. 첫 번째는 유전자 돌연변이(gene mutation)를 지표로 하는 것, 두 번째는 염색체이상(chromosomal aberration)을 지표로 하는 것, 세 번째는 DNA에 대한 상해성 또는 그 수복성(DNA damage or repair)을 지표로 하는 것, 네 번째는 기타의 것이다. 어느 방법이든지 시험관내(in vitro)와 생체내(in vivo) 시험법이 있다.

 

유전독성시험은 시험물질의 발암성을 예측하기 위한 단기 검색법의 하나로 중요한 역할을 하여 왔다. 그러나 의약품의 안전성을 평가하는 경우, 유전독성시험은 발암성 평가에만 국한되는 것은 아니다. 예를 들면, DNA에 대한 상해성이 태아에 미친다면 최기형성(teratogenicity)으로 연결되고, 또한 생식세포(정자 또는 난자)에 영향을 미치게 된다면 다음 세대에 유전적 상해(genetic hazard)가 전달될 수 있다.

 

과거 유전독성시험에서 얻어진 결과는 단순히 정성적으로 평가되는 경향이 있었다. 그러나 그 동안의 연구결과에 따르면 시험물질의 종류에 따라 유전독성의 강도(변이활성)가 수백만 배의 차이가 있다는 것으로 알려졌다. 특정한 시험계에서 양성으로 판정된 경우에는 그 활성을 정량적으로 파악하는 것이 중요하다. in vitro 시험계에서 양성이어도 in vivo 시험계에서 음성이 된 경우도 많다. 유전독성시험 결과를 검토할 때는 의약품의 유용성에 대해 고려하고, 생체 내에서의 흡수, 분포, 대사, 배설 등의 약물동태를 포함하여 다른 독성시험결과와 비교·검토하여 안전성을 종합적으로 평가할 필요가 있을 것이다.

 

유전독성시험 중 독성동태시험은 다음과 같이 적용할 수 있다. 생체 내(in vivo) 유전독성시험에서 음성의 결과가 나온 경우, 동일한 시험종에서의 전신적 노출을 증명하거나 지표 조직에서의 노출의 특성을 확인할 수 있다.

 

항원성시험 (Antigenicity study)

본 기준에서는 의약품의 항원성, 특히 인체에 대해서 페니실린 쇼크와 같은 심각한 부작용 및 독성을 유발할 가능성이 있는 의약품을 검색하기 위한 동물시험법을 제시하고 있다.

 

항원성시험은 전신적으로 투여되는 약물로서 고분자물질, 단백질의약품인 경우와 저분자물질이라 하더라도 합텐으로서 작용할 가능성이 있는 경우(예: 페니실린, 설폰아마이드계) 실시한다. 또한 제제가 유효성분 외에 새로운 첨가 성분(부형제, 안정화제 등)을 함유한 경우에는 이들 첨가제에 대해서도 본 기준에 준하여 항원성시험을 실시할 필요가 있다.

 

아나필락시스 반응의 평가방법으로는 기니픽을 이용한 아나필락시스 쇼크 반응시험 또는 마우스-랫드의 이종 수동 피부 아나필락시스 반응시험이 권장된다. β-락탐계 항생물질의 경우 교차반응성이 검토되어야 하며 약효 및 구조가 유사하여 교차반응성이 예상되는 기타 화합물도 검토할 필요가 있다.

 

혈중 항체가가 아주 높을 때에는 아나필락시스 쇼크 반응시험과 수동 피부 아나필락시스 반응시험에서 모두 양성반응을 나타내지만, 혈중 항체가가 낮으면 수동 피부 아나필락시스 반응시험에서는 음성반응을 나타내면서 아나필락시스 쇼크 반응시험에서 양성반응을 나타낼 수 있으므로 두 시험을 모두 실시할 필요가 있다.

 

아나필락시스 쇼크 반응시험에서 5마리 중 1마리가 양성반응을 나타낸 경우 도는 수동 피부 아나팔락시스 반응시험에서 2마리 중 1마리가 양성반응을 나타낸 경우 의약품의 안전성 평가라는 관점에서 양성으로 판정한다.

 

피부 감작성 시험

 

피부 감작성 시험은 피부 외용제로 사용되는 의약품의 피부 접촉으로 인한 감작성을 예측하기 위한 것으로써 다른 경로, 예를 들어 경구투여 또는 흡입 노출시의 감작성을 검출하려는 것은 아니다. 피부 감작성시험은 면역 보조제를 사용하는 시험과 사용하지 않는 시험으로 구분할 수 있다.

 

면역보조제를 사용하는 시험법은 동물에서의 감수성을 높여 저감작성 물질의 검증을 가능하게 하며 인간에서의 위험성 검출감도를 높이려는 목적으로 사용된다. 면역보조제를 이용하는 시험법으로는 Maximization Test, Adjuvant and Patch Test, Freund's Complete Adjuvant Test, Optimization Test, Split Adjuvant Test가 있다.

 

일반적으로 면역보조제를 사용하지 않는 시험법은 면역보조제를 이용하는 시험법에서 얻어지는 양성소견을 재확인하기 위해서 이용되는 시험법이며, Draize Test, Buehler Test, Open Epicutaneous Test가 있다.

 

「의약품등의 독성시험기준」(식품의약품안전처 고시)은 Maximization Test를 기준으로 설명되어 있는데 일반적으로 Maximization Test가 가장 민감한 시험법으로 생각되기 때문에 상세하게 기술하였고 다른 7가지 시험법을 예시하였다. 그러나 기준에 있는 모든 시험법을 이용해도 좋다.

 

시험물질의 감작성 평가는 단계적으로 실시하는 것이 이상적이다. 즉, 제 1단계는 시험물질의 성질을 확인하기 위하여 면역보조제를 이용하는 5가지 시험법 중 하나를 실시하고, 여기에서 양성반응을 얻은 경우 제 2단계로써 기지 물질과 비교하거나 면역보조제를 사용하지 않는 시험법으로 검색한다면 감작의 강도를 알 수 있다.

 

원칙적으로 시험물질을 실험동물에 감작시키고, 그 후 약 2주간의 휴지기를 가진 다음 시험물질을 사용하여 다시 야기함으로써 과민성반응의 특성여부를 조사하는 데 감작성 유무는 각 시험군과 대조군의 야기에 의한 피부반응을 비교함으로써 판단된다. 아울러 각각의 시험법에는 특징 또는 장단점이 있기 때문에 이것들을 숙지해서 적절한 시험법을 선택하는 것이 바람직하다.

 

면역독성시험 (Immunotoxicity study)

의약품등의 독성시험기준」(식품의약품안전처 고시)에서의 면역독성은 의도하지 않은 면역억제 또는 면역증강으로 정의하고, 의약품에 의해 유도되는 과민반응 및 자가면역 반응은 제외한다. 또한, 각각의 면역독성시험을 어떻게 수행할 것인지의 구체적인 지침은 이 독성시험기준의 범위에 해당하지 않는다.

 

의약품의 잠재적 면역독성을 유발할 수 있는 요소들을 확인할 수 있는 항목은 다음과 같다.

 

① 반복투여독성시험의 결과들

② 면역기능에 영향을 줄 수 있는 의약품의 약리학적 특성 (예, 항염증약)

③ 의약품을 투여할 대상 환자의 대다수가 질병상태 또는 병용요법에 의해 면역력이 약화된 경우

④ 이미 알려진 면역조절제제와의 구조적 유사성

⑤ 의약품 본래의 성질 (모약물 및 그 대사체가 면역계 세포에 고농도로 잔류하는 경우)

⑥ 면역독성을 암시하는 임상정보

 

면역독성 가능성을 처음 확인할 수 있는 것은 초기 단기시험부터 장기간의 반복투여독성시험까지 설치류 및 비설치류에서 얻은 데이터이며, 고려해야 할 징후들은 다음과 같다.

 

○ 백혈구, 과립백혈구, 림프구의 감소 및 증가와 같은 혈액학적 변화

○ 면역계통 장기의 중량 또는 조직학적 변화(예: 흉선, 비장, 림프절 또는 골수)

○ 간이나 신장독성에 의하지 않은 혈청 글로불린 변화

○ 감염의 발생빈도 증가

○ 유전독성, 호르몬 효과 또는 간 효소 유도와 같이 다른 타당한 원인이 없는 종양발생의 증가

 

위에 기술한 모든 요소들에 의한 정보를 가지고 면역독성시험이 필요한지 검토를 수행해야하며, 고려해야 할 이유가 명확하면 의약품의 면역독성 가능성을 확인하기 위해 면역독성시험을 수행해야 한다.

 

발암성 시험 (Carcinogenicity study)

발암성 시험은 동물에서의 종양 유발을 검색함으로써 사람에서의 발암성 위험을 예측하기 위해 수행된다. 화학구조나, 화학적 성질, 동물을 이용한 독성시험, 혹은 사람에서 시험결과로부터 발암성이 염려되는 경우, 더욱이 환자에게 상당기간동안 지속적으로 투약될 것으로 예상되는 의약품을 개발하는 경우에는 발암성 시험이 필요하다. 우리나라에서는 의약품의 품목허가·신고·심사 규정에서와 같이 임상에서의 사용기간이 6개월을 초과하는 의약품(예: 류마티스성 만성관절염에 사용하는 소염진통제, 본태성 고혈압에서 사용하는 혈압강하제 등)의 경우에는 의약품등의 안전성 심사를 위하여 발암성 시험 자료를 제출하게 되어 있다. 그러나 6개월 미만에 있어서도 발암성이 예측되는 의약품에서는 발암성 시험이 필요하다. ICH에서는 이와 같은 의약품에 대해서 발암성 시험을 요구하는 것에 관해서 검토가 이루어져, 합의에 이르렀다(참고: ICH 안전성 가이드라인「의약품에 있어서 발암성 시험의 필요성(S1A)」).

 

의약품에서 발암성이 염려되는 경우는 ➀ 유전독성시험 결과 시험물질의 노출에 의해 인체 발암 가능성이 있는 경우 ➁ 구조적으로 유전독성 혹은 발암성이 의심되는 구조-활성 상관성이 있는 경우 ➂ 반복투여독성시험 결과 전암병변 변화 등 발암성을 시사하는 소견이 보이는 경우 ➃ 모 화합물 또는 대사산물이 장기간 조직에 정체하여 조직변화나 병적 반응을 야기시키는 경우 등을 들 수 있다.

 

특정의 난치성 질환의 치료에 사용하는 희귀의약품에서는 발암성 시험이 특별히 요구되지는 않는다. 그러나 희귀의약품에서 해제되어 다수의 사람에게 적용되거나 다른 목적으로 적용되는 경우는 발암성 시험이 실시되어야 한다. 예를 들면, 대체 치료법이 없는 악성종양을 치료하는 것을 목적으로 하는 항암제 등에서는 발암성 시험이 반드시 요구되지는 않는다. 그러나 적응증 추가 혹은 변경 시 암 이외의 환자에 적용되는 경우는 그 후 이차적인 발암의 염려가 있기 때문에 발암성 시험을 필요로 한다.

 

국소독성시험 (Local Toxicity study)
- 피부자극시험(Skin Irritation Test)

 

피부에 적용되는 시험물질의 피부노출에 따른 피부자극을 평가하는 시험이다. 폐색첩포를 이용하는 방법이 가장 보편적으로 사용되고 있으며, 백색토끼를 사용한다. 시험물질을 피부에 도포 후 염증반응에 의해 나타나는 홍반과 가피, 부종을 관찰하여 자극성을 판정하는 시험법이다. 충혈에 의한 피부 발적 등 여러 가지 원인으로 인하여 피부에 나타나는 적색반응을 홍반이라 하며 신체의 분비물이 건조하여 형성된 고형물을 가피라 하고, 체액이 조직에 축적되어 부어오른 것을 부종이라 한다.

 

 

국소독성시험 (Local Toxicity study)
- 안점막자극시험(Eye Irritation Test)

안점막자극시험은 안점막에 접촉하거나 접촉할 우려가 있는 물질의 자극성을 평가하기 위한 시험으로 백색토끼를 사용한다. 백색토끼는 색소가 없는 큰 눈을 가져 안과학 검사에 적합하며, 자극성 물질에 대한 감수성이 높은 것으로 알려져 있다. 토끼의 한쪽 눈에 시험물질을 1회 처치하여 시험군으로 사용하고 처치하지 않은 다른쪽 눈을 대조군으로 하며 각막, 홍채 및 결막의 손상정도에 따라 안 자극성을 판정하는 시험이다.

 

국소내성시험 (Local Tolerance study)

국소내성시험은 시험물질이 투여되는 신체 부위의 내성 반응을 보기 위해 실험동물의 주사부위(예: 정맥, 근육, 피내, 피하주사 등)에서 나타나는 임상․병리학적 반응을 검사하는 시험을 말한다. 시험방법은 「의약품등의 독성시험기준」(식품의약품안전처 고시)과 유럽 EMEA의「의약품의 비임상 국소내성시험에 대한 가이던스」(Non-clinical local tolerance testing of medicinal products, CPMP/SWP/2145/00, 2001) 등을 참고할 수 있다.

 

흡입독성시험 (Inhalation Toxicity study)

흡입독성시험은 기체, 휘발성 물질, 증기 및 에어로졸 상태 등의 물질을 포함하고 있는 공기를 실험동물에 흡입 투여하여 나타나는 독성을 검사하는 시험을 말한다. 「의약품등의 독성시험기준」(식품의약품안전처 고시)에서는 단회투여흡입독성시험과 반복투여흡입독성시험이 구분되어 있으나, 본 장에서는 통합하여 설명하였다. 사용되는 시험물질로는 부탄, 프로판, SO2, NO2, 오존 등과 같은 기체, 톨루엔 등 휘발성이 강한 유기용매, 분사용 살충제 및 농약 등 에어로졸 물질이 해당한다. 그리고 투여 횟수에 따라 단회투여흡입독성시험과 반복투여흡입독성시험으로 나눌 수 있다. 흡입독성시험은 시험물질이 정하여진 시간동안 연속적이고 일정하게 분사 및 투여될 수 있도록 특별히 고안된 장비(흡입챔버, inhalational exposure chamber)를 사용하여야 한다.

 

 

복합제의 독성시험 (Combination drug Toxicity study)

 

복합제에 대한 독성시험은 주로 단회투여독성시험과 반복투여독성시험 그리고 기타독성시험 중 국소독성시험(점막자극시험)을 필요에 따라 수행하여야 한다. 복합제에 대한 단회투여독성시험, 반복투여독성시험 그리고 국소독성시험의 시험방법은 「의약품등의 독성시험기준」(식품의약품안전처 고시)에 제시되어 있다. 그러나 기 허가된 성분으로 복합제를 개발하는 경우 병용투여의 타당성, 약물상호작용, 다수의 병용처방 사례 등을 종합적으로 고려하여 독성시험 자료 제출이 면제될 수 있다. 생약이나 한약과 같은 천연물의약품의 복합제제의 경우「천연물의약품 비임상자료 가이드라인」(2011.6.)을 참고한다.

 

독성동태시험 (Toxicokinetic study)

 

「의약품등의 독성시험기준」(식품의약품안전처 고시)에서는 독성동태시험을 별도의 시험으로 분류하고 있지 않다. 그러나 단회투여독성시험, 반복투여독성시험, 생식·발생독성시험, 유전독성시험, 항원성시험, 발암성시험에서 필요 시 독성동태시험을 적용할 수 있도록 하고 있다. 이에 본 장에서는 일반적인 독성동태시험에 필요한 사항을 기술하였다.

 

의약품 후보물질에 대해 독성시험을 하는 목적은, 동물실험이나 in vitro 시험에 의한 약물의 독성 영향을 용량, 투여기간 및 투여경로에 따라 밝힘으로써, 인체에서의 독성을 추정하는 것이다. 그러나 독성의 발현은 아래 표에서처럼 여러 가지 인자에 의해 영향을 받으므로, 실험동물에서의 결과를 인체에 외삽할 때에는 주의가 필요하다. 독성발현에 차이가 생기는 원인은 약물의 흡수, 분포, 대사, 배설에 의한 차이, 즉, 약물동태학(pharmacokinetics)적 차이와 표적장기에 있어서의 반응성의 차이로 대별할 수 있다.

약물동태학적 차이에 관해서는 인간과 실험동물의 혈액 중 약물농도를 측정하고 비교 평가하는 것으로부터 많은 정보를 확인할 수 있다. 「독성동태」라는 용어의 정의는 대상으로 하는 물질이나 연구분야에 따라 서로 다를 경우가 있다. 즉, 인간에서의 약효를 기대하는 의약품이 몸 안에 들어오는 동태를 약물동태로 하고, 약효를 기대하지 않는 농약이나 일반 화학물질의 동태를 독성동태라고 일컫는 경우가 있다. 또한, 독성이나 안전 용량 등 독성학자의 특수한 관심을 강조하여 약물동태 중 의약품의 부작용이나 화학물질 등의 독성발현에 초점을 맞춘 것을 독성동태라고 부르는 경우도 있다.

ICH에서 합의된 독성동태 가이드라인에서는 “전신적 노출을 평가하기 위해 비임상시험의 수행과정 중 일부 또는 별도의 보조 시험으로서 약물동태 자료를 얻는 것”이라고 정의하고 있다. 「의약품등의 독성시험기준」(식품의약품안전처 고시)에서는 독성동태를 “독성시험 수행 시 시험물질의 전신 노출도를 평가하기 위하여 약물동태학적 자료를 산출하는 시험”이라 정의하였으며, “시험물질의 노출도와 독성시험에서의 용량단계 및 시간경과와의 상관성을 연구하는 것”을 목적으로 한다.

 

독성동태시험을 진행하는 2차적인 목적으로는 ① 노출양상과 독성소견을 연관 지음으로써 이러한 독성소견과 임상에서의 안전성과의 상관성 평가에 기여하고, ② 비임상시험에서 동물 종 및 투여방법의 선택에 필요한 자료를 제공하고, ③ 독성소견과 관련하여 추후에 진행되는 비임상시험의 계획 수립에 도움을 주는 정보를 제공하는 것이다.